摘要:在質量指南Q8和最近的皮膚外用制劑的質量和等效性指南草案中，對產品和工藝理解的要求越來越高，揭示了流變學方法作為外用半固體劑型微結構表征工具的巨大潛力。因此，程序標準化是迫切需要。這項工作旨在開發(fā)和驗證流變學分析的方法指南。用1%氫化可的松乳膏作為模型乳膏制劑。通過風險評估分析，對所選關鍵方法變量(幾何形狀、溫度和應用模式)的影響進行了廣泛的流變關鍵屬性評估，包括零剪切黏度、上剪切稀化黏度、下剪切稀化黏度、無限剪切黏度、旋轉屈服點、觸變相對面積、線性黏彈性區(qū)域、振蕩屈服點、儲能模量、損耗模量和損耗角正切。該方法的擬議驗證包括流變儀鑒定，隨后是關于流變特征采集的眾多操作關鍵參數的驗證。觸變相對面積、振蕩屈服點、流動點和黏度相關的終點被證明是高度敏感和有區(qū)別的參數。這一基本原則為開發(fā)可靠和穩(wěn)健的流變特征采集提供了標準框架。

關鍵詞:流變學；方法驗證；設備驗證；外用制劑；監(jiān)管要求

1.     引言

   外用半固體劑型包括復雜的多相系統(tǒng)，需要詳細的流變學表征，因為這些特性可能會顯著影響質量和性能[1，2]。流變學是研究材料的流動和變形行為，可以通過對樣品施加外力(剪切誘發(fā)變形)來測量[3]。與配方黏度、彈性和塑性相關，流變行為可能會影響產品制造、外觀、包裝、長期穩(wěn)定性、分散、感官特性和體內性能[4，5]。因此，流變評估被證明是一種有用的質量和穩(wěn)定性指標，揭示了有關批次穩(wěn)定性、產品美學特性、治療效果和患者依從性的預測信息[2，6，7]。加強對流變參數的理解和控制是新藥或仿制藥申請的可持續(xù)發(fā)展的基礎，滿足利益相關者的期望[8]。

外用半固體劑型主要表現出非牛頓行為，因為較高的剪切速率會導致黏度降低，這使得在皮膚上使用變得更容易[9]。因此，配方開始流動需要一定的臨界應力值(屈服應力)。小于這個數值，產品主要呈現彈性；相反，大于該數值，材料主要顯示塑性流動[10]。

類似地，有許多流變學屬性直接影響外用產品的微觀結構，從而影響藥物的很多個方面。例如，制劑在皮膚上的鋪展性和生物黏附性受黏彈性的影響很大。當患者直接在皮膚上涂抹外用制劑，這些感官屬性對于確保患者的可接受性以及治療依從性至關重要[10–13]。

穩(wěn)定性和物理外觀也取決于流變特性。詳盡的流變特性為產品在貨架期內沉淀或分離的原因提供了有價值的分析。此外，該方法可以確定無論任何時候，采取包裝軟管給藥還是計量泵[10]給藥，是否會對產品的微觀結構有顯著影響。還可以反映生物制藥特性，例如藥物釋放和滲透也依賴于配方的流變特性[13，14]。鑒于上述所有原因，流變行為是半固體制劑目標藥物質量概況的關鍵質量屬性[5，10，15]。

流變特性高度依賴于關鍵藥物原料(CMAs)和關鍵工藝參數(CPPs)，因此，密切的流變監(jiān)控可以成為指導和縮短產品開發(fā)、確保產品質量和減少制造過程中批次差異的有用工具[7]。這符合制藥行業(yè)日益增長的對工藝的理解和提高產品質量的需求。這也是質量源于設計(QbD)的基本原則。這種新的制藥監(jiān)管概念是以一種系統(tǒng)的、基于風險的方法為基礎提出的，通過對原材料和工藝參數的詳細了解來調整所需的產品質量狀況[11，16，17]。

QbD方法首先涉及目標藥物質量概況(QTPP)和關鍵質量屬性(CQAs)的定義，其中流變特性應是首要關注的問題。之后，通過詳細的風險分析，應該清楚的識別關鍵材料屬性和關鍵工藝參數。建立好這些參數后，應進行實驗設計(Does ),以便最終建立設計區(qū)間和可行的控制策略[11，16，17]。最后一步是最重要的，因為這一步確保這一過程是可控的，而且保持在確定的設計區(qū)間內[18]。利用了過程分析技術(PAT)的制造過程中的測量可以整合為控制策略的一部分。盡管過程分析技術越來越多地應用于固體劑型，但其在半固體制劑中的應用還不是一種常見的解決方案[19]。一些作者已經探索了流變學作為過程分析技術工具的潛力。

Qwist等人開發(fā)了一種壓差裝置，可從大量中間產品/產品流中取樣，并通過頻率掃描確定儲能模量(G′)和損耗模量(G″)，以及測試流動曲線[ 19]。此外，Van Heugten及其同事評估了灌裝溫度對軟膏屈服應力的影響。基于這一知識，作者能夠建立一個最佳的灌裝黏度范圍，這反過來又能夠保證罐裝時最小的重量變化，以及最終產品期望的屈服應力[20]。

一旦控制策略的可變性被深刻理解，如果遵循QbD原則，一個更加靈活的監(jiān)管批準就可以得以實現。作為控制策略的一部分，通過降低產品批間差和提高產品穩(wěn)定性，流變學作為過程分析技術工具，有助于提升藥物配方和制造能力[11，16]。

正如外用制劑質量和一致性評價的草案指南中強調的那樣，在開發(fā)一款藥物產品的時候，以病患為中心的要求應當加以重視。因此，正如前面提到的，以下幾個方面，例如高度依賴于流變學特性的患者可接受度，在開發(fā)藥物的時候需要首先考慮。這對新藥產品是有效的，同時對處理仿制藥物也具有重要意義的。

作為臨床終點研究的替代方案的EMA指南草案，是一個外用仿制藥等效性評價的標準框架。因此，為了藥物的申請，拓展了的藥物等效性標準必須得以滿足。（i） 定性、定量和微觀結構與參照樣品的一致性（分別為Q1、Q2、Q3）；（ii）產品體外釋放的性能測試（Q4），以及最終的，（iii）如果測試樣品被認定是復雜的制劑，等效性驗證應當通過體外皮膚透過或者皮膚動力學研究進行驗證。

在這種情況下，微觀結構等效性驗證是外用仿制藥生物等效性評估的最重要部分。

經文獻廣泛描述的多種因素，影響藥物產品的微觀結構，這其中流變學特性具有無可辯駁的作用。因此，EMA提出了描述給定藥物制劑流變學行為的流變學參數。這些參數包括：（i） 完整的剪切流動曲線：應力（或粘度）與剪切速率的關系；（ii）屈服點值；（iii）線性粘彈性響應，（iv）儲存模量和損耗模量與頻率/應力的關系；和（v）觸變相對面積。盡管FDA需要提供流變終點，與EMA相比，該列表并不詳盡。

然而，盡管存在一些關于流變學適用性和整體重要性的文獻報告，但對這一技術的正式驗證程序缺乏理解和標準化。迄今為止，文獻中既沒有定義半固體制劑流變特性的參數，也沒有定義它們的接受極限。此外，在放行新批次時，重要的流變參數不包括在常規(guī)分析中[6]。在這種情況下，應提供適用于所有半固體劑型的廣泛驗證，確保開發(fā)的流變學測量方法具有適當的鑒別能力，以確定制劑的“一致性”，并檢測可能影響臨床表現的制劑差異[26]。此外，還應提供詳盡的具有強制性質量參數的流變學特征。

為了實現流變方法的標準化，無論是用于輔助質量控制還是潛在的過程分析技術工具，我們對可能影響流變特性的流變操作參數進行了全面表征。為此，分析質量源于設計(aQbD)的假設，包括用于對關鍵方法變量(CMV)對關鍵分析屬性(CAA)的影響進行排序的風險評估，被認為是對流變儀的操作范圍、實驗設置和流變測量方法進行系統(tǒng)驗證，以獲得合適的流變學特征。

考慮到常規(guī)分析驗證的所有相關因素，包括測試精度、區(qū)分·能力和可靠性，進行了特定的旋轉和振蕩測量以及數據分析[27]。1%（w/w）氫化可的松乳膏被用作模型產品。指南草案中指出的關于外用產品的質量和等效性的其他建議也同樣得到了處理[21]。

2.         材料和方法

2.1.材料

微粉化氫化可的松乳膏由Laboratórios Basi Indústria Farmacêutica S.A.友情提供。（Mortágua，葡萄牙）。對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯分別是購自阿爾法埃莎（德國坎德爾）。Kolliwax GMS II（甘油單硬脂酸酯），KolliwaxCA（鯨蠟醇）、Kollicream IPM（肉豆蔻酸異丙酯）和 Dexpanthenol Ph. Eur. 由巴斯夫歐洲公司（德國路德維希港）友情提供。硬脂酸由Acorfarmadistribuicion S.A提供.（西班牙馬德里）。三乙醇胺購自 Panreac AppliChem（德國達姆施塔特）。液體石蠟由LabChem Inc.（美國賓夕法尼亞州Zelienople）提供。甘油購自VWR Chemicals（比利時魯汶）。水被凈化（Millipore）并在使用前通過0.22毫米的尼龍過濾器過濾。黏度參考標準液RT5000（Fungilab，Spain）用于流變儀鑒定研究。

1. 2.2 方法

2. 2.2.1 氫化可的松乳膏的制備

氫化可的松乳膏 o/w乳膏制劑通常借助于Ultra-Turrax X 10/25 (Ystral GmbH，Dottingen，德國)設備制備。連續(xù)相和分散相分別制備，并加熱至70°C[11，28]。之后，活性藥物成分溶解在分散相中。先前的研究建立了與制造過程的速率、持續(xù)時間和溫度相關的最佳實驗設置。生產后，將乳膏制劑冷卻至室溫。每批次制備0.5千克。所有樣品都儲存在20–25°c下

為了證明流變儀器的鑒別能力，考慮到單硬脂酸甘油酯的不同濃度，制備了三種配方: 5% (F5)，10% (F10)和20% (F20)。由于其增稠特性，這種賦形劑對產品微觀結構具有重大影響[11，28]。請注意，F10被視為參考配方。此外，用10%的單硬脂酸甘油酯制備第四種制劑，但是考慮到制造過程中不同的均化速率。該配方將作為F10陰性對照(F10NC)進一步處理。

1. 2.2.2流變特性

使用HAAKE MARS 60 (賽默飛，Karlsruhe，德國)研究了所有產品的流變特性，該儀器配備有作為溫度控制單元的半導體系統(tǒng)。使用Haake RheoWin數據管理軟件(德國卡爾斯魯厄，Thermo Scientific)評估數據。對于每次分析，樣品罩用于最大限度的減少溫度波動。

考慮到EMA最近發(fā)布的關于局部產品質量和等效性的指南草案，完整的流變特性應包括旋轉和振蕩測量[21]。

旋轉測試是樣品破壞性的。從這些測量中檢索的信息使得能夠評估影響結構破壞和/或重新排列的小的周期性變形。此外，通過這些測試，還可以研究材料的恢復能力。

關于振幅和頻率掃描測試的振蕩測試。一般來說，由于所施加的剪切應力減小，這些測量可以被認為是非破壞性的，然而，應該指出的是，在振幅掃描測試過程中，仍然會出現較小的系統(tǒng)擾動。振蕩測量旨在評估材料的黏彈性，同時伴隨著小振幅變形力[28]。以下各節(jié)詳細介紹了這兩種方法的主要成果。

旋轉測量

使用C35/2 /Ti錐形轉子在32℃下進行旋轉試驗。使用正位移注射器將大約0.3克制劑置于TMP35的下板上。設置0.1毫米的預設間隙。

從0.01到250 Pa的線性CS階躍測試，時間800 s，以描繪流動曲線[? = f(τ)]。為了表征流動行為，檢測接下來的響應或關鍵分析屬性(CAA):零剪切黏度(?0)、高剪切稀化黏度(?U)、低剪切稀化黏度(?L)、無限剪切黏度(?∞)和屈服點(τ0)。

為了評估觸變性能，在300 s-1[τ=f(??]期間，以0.01至300s-1的剪切速率進行CR連續(xù)掃描試驗，然后再降至0.01。從該分析中，計算觸變相對面積(SR)。

振蕩測量

使用P35/Ti平板轉子在32℃下研究黏彈性。使用注射器將約1g制劑施加到TMP35的下板。首先在1Hz的頻率下進行從0.01到600Pa的振幅掃描測試，以評估線性黏彈性區(qū)(LVR)平臺，屈服點(τ0，振蕩模式)和流動點(τf)。之后，在LVR平臺內進行了頻率掃描分析。在1Hz下計算儲能模量(G′)、損耗模量(G″)和損耗角正切(tan δ)。

2.2.3流變方法驗證

目前的工作旨在建立一種實用且簡單的方法來驗證流變分析。在這種情況下，按照傳統(tǒng)的驗證程序，確定了精確度和可靠性，以及靈敏度、特異性、選擇性(辨別能力)[21，29]。請注意，線性不被視為流變方法驗證的相關參數，因為在流變曲線的采集中不存在固有的線性。

風險評估

根據以前的知識，可以廣泛地評估可能對流變終點產生直接影響的分析條件。為了確定這些參數中哪些需要進一步研究和控制，構建了一個魚骨圖，見圖1。此外，還進行了風險評估矩陣(REM)來對之前確定的分析條件進行排序，見表1 [17，30]。

圖1.應用于流特征采集和驗證的假想魚骨圖

表1.流變學方法驗證的初始風險評估矩陣(REM)

關鍵: 低風險變量(L)；中等風險變量(M)；高風險變量(H)。

設備鑒定

通過確定參考標準品的黏度特征來進行流變儀鑒定。考慮了兩個溫度，25°C和32°C。第一個溫度符合標準的規(guī)定，而第二個溫度目的是為了重現之前報告中的方法條件。

為了評估方法精度，在三個不同的日期進行了三次測量。

精確度

為了測試精度，每項測試在三個不同的日期進行了十二次流變測量，以符合歐洲藥品監(jiān)督局的最新要求。在驗證先前定義的終點時，可以接受小于15%的相對標準偏差。 [6，31]。

區(qū)分能力

驗證程序中最重要的步驟之一是評估方法的鑒別能力，即方法鑒別不同配方的能力。為了解決這一問題，應證明方法的靈敏度、特異性和選擇性[21，31，32]。

對F5、F10和F20的流變特性進行了交叉對比。此外，F10NC流變剖面被確定為一個額外的判別因素。通過跟蹤這類制劑的流變特性，可以驗證該方法的鑒別能力，因為微結構差異對輔料的濃度和生產工藝的變化高度敏感[5,21,23,33–35].在這種情況下，通過評估關鍵分析屬性對單硬脂酸甘油酯濃度變化的響應來驗證流變方法的靈敏度。如果F5測得的關鍵分析屬性低于F10，并且F20關鍵分析屬性平均值優(yōu)于F10，則認為流變方法是敏感的。

另一方面，通過評估F5、F10和F20的關鍵分析屬性是否能夠成功地反映不同的單硬脂酸甘油酯含量來評估該方法的特異性。使用因變量為增稠劑濃度的關鍵分析屬性的線性回歸模型來估計相關系數(R2)。如果R2大于0.9，則該方法被認為是特異的[31，33，36]。方法選擇性以統(tǒng)計方式記錄。在參考配方(F10)和特別制造的配方F5、F20和F20CN之間進行成對比較。對于p < 0.05的值，平均值之間的差異被認為是顯著的。如果每種制劑的關鍵分析屬性存在顯著差異，則認為該方法具有選擇性。在鑒別能力研究中，每種配方有六個重復，每次流變測量都要考慮。

穩(wěn)定性

為了評估方法的穩(wěn)定性，評估了三種不同實驗設置的影響。這些因素包括溫度波動(+2°C和–2°C)、樣品應用(容積式注射器與抹刀)以及最終轉子的影響。對于旋轉研究，C35/2 /Ti錐TMP35板(C35-P35)配置的性能與P35/Ti板-TMP35板(P35-P35)配置進行了比較。對于振蕩測量，比較了P35/Ti板TMP35板(P35-P35)配置與P20/Ti板TMP20板(P20-P20)配置的影響。如果在標準方法參數設置下，關鍵分析屬性偏離平均關鍵分析屬性不超過15%,則該方法被認為是穩(wěn)定的。

2.2.4統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 5軟件(美國加利福尼亞州圣地亞哥)通過使用帶有Tukey多重比較法的單因素方差分析進行統(tǒng)計分析。當p < 0.05時，平均值之間的差異被認為具有統(tǒng)計學意義。